Kromatografi – definition, principer och användning inom kemi

Kromatografi är en metod som använder blandade ämnen som beror på hur snabbt de rör sig genom särskilda medier eller kemiska ämnen. Den består av en stationär fas (ett fast ämne) och en rörlig fas (en vätska eller en gas). Den mobila fasen strömmar genom den stationära fasen. Kromatografi används mycket inom biokemi och analytisk kemi.

Principer

Kromatografisk separation bygger på att olika komponenter i en blandning interagerar olika starkt med den stationära respektive den rörliga fasen. Komponenten som interagerar svagast med den stationära fasen följer med den rörliga fasen snabbare och eluerar först. De viktigaste mekanismerna är:

• Adsorption – ämnen fäster på ytan av den stationära fasen (vanligt i tunnskikts- och kolumnkromatografi).
• Partition – fördelning mellan två flytande faser (t.ex. i vätskekromatografi).
• Jonbyte – separation baserad på laddning (används för joner och polära molekyler).
• Storleksuteslutning (SEC/GPC) – molekyler separeras efter storlek; större molekyler eluerar först.
• Affinitet – selektiv bindning mellan målsubstans och en ligand i den stationära fasen (vanligt inom rening av proteiner).

Vanliga typer av kromatografi

• Papperkromatografi – enkel form för skol- och kvalitativa analyser.
• Tunnskiktskromatografi (TLC) – snabb screening och kontroll av reaktioner.
• Kolumnkromatografi – preparativ separation i labbskala (silica- eller aluminiumbaserad).
• Gaskromatografi (GC) – för flyktiga och termiskt stabila ämnen, ofta kopplat till masspektrometri (GC–MS).
• Högpresterande vätskekromatografi (HPLC/UPLC) – mycket användbar för polaritet, läkemedel, metaboliter och kemisk analys; kan kopplas till detektorer som UV eller MS.
• Jonbyteskromatografi – för separation av syror, baser och salter.
• Affinitetskromatografi – selektiv rening av biomolekyler genom bindning till immobiliserade ligander.

Detektorer och analys

Efter separation måste ämnen oftast detekteras. Vanliga detektorer är:

• UV/Vis – vanlig vid HPLC för aromatiska och konjugerade ämnen.
• Refraktiv index (RI) – generisk men mindre känslig, används för kolhydrater och polymerer.
• Fluorescens – mycket känslig för fluorescerande föreningar.
• Masspektrometri (MS) – ger både känslig kvantifiering och molekylär information (vanligt vid GC–MS och LC–MS).

Användningsområden inom kemi

Kromatografi är central i många analytiska och preparativa tillämpningar:

• Reningsmetoder för syntetiska produkter eller naturliga extrakt.
• Kvantitativ och kvalitativ bestämning av föroreningar, läkemedel och metaboliter.
• Miljöövervakning (t.ex. pesticider, flyktiga organiska föreningar).
• Proteomik och metabolomik inom biokemi och molekylärbiologi.
• Rättsmedicinska analyser, livsmedelskontroll och klinisk diagnostik.

Praktiska överväganden

Vid metodutveckling väljer man lämplig kombination av stationär fas, mobil fas och detektor beroende på provets egenskaper. Några tips:

• Använd provrensning (filtrering, extraktion) för att undvika kolonnförgiftning.
• Optimera flöde, temperatur (särskilt för GC) och gradient (vid HPLC) för bästa separationstid och upplösning.
• Använd interna standarder för kvantitativ analys och kalibreringskurvor för noggrannhet.
• Tänk på kompatibilitet mellan prov och detektor (t.ex. saltsubstanser kan påverka MS).

Fördelar och begränsningar

Fördelar: hög upplösning, bred tillämpbarhet, möjlighet till både analys och preparativ separation, och koppling till känsliga detektorer.

Begränsningar: viss metodutveckling krävs, kostnad för instrument (särskilt HPLC/GC–MS), begränsad kompatibilitet mellan prov och vissa kolonner eller detektorer samt avfalls- och lösningsmedelshantering.

Kort historik

Kromatografins grundidéer utvecklades i början av 1900‑talet; en viktig pionjär var Mikhail Tsvet som använde kolonnkromatografi för separation av växtpigment. Sedan dess har tekniken utvecklats kraftigt och blivit central inom modern kemi och biokemi.

Säkerhet och miljö

Hantera organiska lösningsmedel och gaser enligt laboratoriums rutiner. Minimera avfall genom metodoptimering och välj miljövänligare lösningsmedel när det är möjligt. Följ lokala regler för avfallshantering och emissioner.

Sammanfattningsvis är kromatografi en flexibel och kraftfull grupp av metoder för separation och analys, med många varianter anpassade till olika typer av prover och frågor inom biokemi och analytisk kemi.

Kromatografi i platt plan

Den stationära fasen är en plan yta, t.ex. papper, eller ett ämne på glas.

Papperskromatografi

Papperskromatografi är en teknik för att separera och identifiera blandningar som är (eller kan vara) färgade. Den har till stor del ersatts av tunnskiktskromatografi, men är fortfarande ett kraftfullt undervisningsverktyg. Dubbelvägskromatografi på papper, även kallad "tvådimensionell kromatografi", använder två lösningsmedel och roterar pappret 90° däremellan. Den är användbar för att separera komplexa blandningar av föreningar med liknande polaritet, t.ex. aminosyror. De föreningar som används inledningsvis garanterar att du vet om färgen är ren (endast ett ämne) eller om det rör sig om en blandning (flera ämnen).

Tunnskiktskromatografi

Tunnskiktskromatografi (TLCC) är en vanlig laboratorieteknik som liknar papperskromatografi. I stället för en stationär fas av papper används ett tunt lager av adsorbent som kiselgel, aluminiumoxid eller cellulosa på ett plant substrat. Jämfört med papper har den fördelen av snabbare körningar, bättre separationer och möjlighet att välja mellan olika adsorbenter. För ännu bättre upplösning och för att möjliggöra kvantifiering kan högpresterande TLC användas.

 
Kromatografisk burk  

Kolonnkromatografi

Kolonnkromatografi separerar föreningar med hjälp av många kemiska åtgärder mellan kemikalien som testas och kromatografikolonnen (en stav med en blandning av speciella kemikalier). Kolonnen drivs antingen med hjälp av gravitation eller en pump.

Den blandade substans som ska testas tillsätts i en liten mängd och bromsas genom viss kemisk eller fysisk aktivitet med kemikalierna i kromatografikolonnen. Hur långsam den är beror på typen av kemikalier i det ämne som ska testas och på de olika faserna. Den tid vid vilken en viss kemikalie eluerar (kommer ut ur kolonnens ände) kallas "retentionstid" och man tror att det bara finns en för en kemikalie.

Den vanligaste stationära fasen för kolonnkromatografi är kiselgel, följt av aluminiumoxid. Cellulosapulver har använts tidigare. Den rörliga fasen är antingen ett rent lösningsmedel eller en blandning av lösningsmedel. Den väljs så att tiden och mängden lösningsmedel som används är så liten som möjligt, samtidigt som de kemikalier som testas tydligt separeras.

 
Resultat av högpresterande vätskekromatografi  

Frågor och svar

F: Vad är kromatografi?

F: Vilka faktorer avgör resultatet av kromatografi?

F: Vilka är de två faser som ingår i kromatografi?

F: Hur rör sig den mobila fasen genom den stationära fasen vid kromatografi?

F: Vilka är de viktigaste områdena där kromatografi används?

F: Vad är den stationära fasen i kromatografi?

F: Vad är den mobila fasen i kromatografi?

Sök med bokstav