Transfektion – överföring av DNA/RNA till celler: definition & användning
Transfektion: metod för att överföra DNA/RNA till celler — principer, tillämpningar inom forskning och genterapi samt tekniker för effektiv och säker genleverans.
Transfektion är en process där man avsiktligt för in DNA eller RNA i celler. Ordet bildas av transformation och infektion. Termen används för flera olika situationer:
- Transformation av bakterieceller med virala nukleinsyror.
- Transformation av djurceller i vävnadskultur med renat DNA som införs i cellernas arvsmassa.
- Transformation av celler eller embryon med enkel- eller dubbelsträngat RNA, vilket kan leda till att vissa proteiner uttrycks eller att vissa gener tystas.
- Genterapi där ett modifierat virus används som vektor för att leverera genetiskt material.
Överblick: typer av transfektion
- Transient transfektion – framkallar temporärt uttryck av det införda materialet (vanligt vid RNA- eller plasmidtransfektion då materialet inte integreras i genomet).
- Stabil transfektion – det införda DNA:t integreras i cellens genom eller bibehålls i cellpopulationen (t.ex. via selektion), vilket ger varaktigt uttryck över celldelningar.
- Viral transfektion (transduktion) – använder virusvektorer för effektiv leverans, ofta vid svårtransfekterbara celltyper eller för in vivo-användning.
Metoder för transfektion
Det finns flera tekniker, val beror på celltyp, material (DNA eller RNA) och avsedd effekt:
- Fosfatkalcium – en klassisk kemisk metod för plasmid-DNA i odlade celler.
- Lipidbaserade reagenser (lipofection) – vanliga kommersiella kit där lipider bildar komplex med nukleinsyror och underlättar upptag via endocytos.
- Polymerer (t.ex. polyethylenimin, PEI) – kemiska bärarmolekyler som bildar nanopartiklar med DNA/RNA.
- Elektroporation – pulsad elektrisk stöt som tillfälligt permeabiliserar cellmembranet; effektiv även för svårtransfekterbara celler eller primära celler.
- Microinjektion – direkt injektion i cellkärnan eller cytoplasman; används ofta i embryon eller enstaka celler.
- Fysikalisk metod: sonoporation, magnetofection – ultraljud eller magnetiska nanopartiklar kan användas för att förbättra leverans.
- Virusvektorer – adenovirus, adeno-associerade virus (AAV), lentivirus m.fl. används för effektiv och ibland långvarig leverans.
Tillämpningar
- Funktionell genforskning: överuttryck eller tystning av gener för att studera fenotyper.
- Proteinproduktion i cellkultur för biokemi eller läkemedelsutveckling.
- RNAi och siRNA/miRNA-studier för att reducera målgeners uttryck.
- CRISPR/Cas9-genredigering genom leverans av komponenter (DNA, mRNA eller RNP-komplex).
- Genterapi och in vivo-leverans av terapeutiska gener med viral eller icke-viral teknik.
Risker, begränsningar och biverkningar
- Transfektion kan ge celltoxisk effekt och förändrade morfologier; vissa metoder är mer skadliga än andra.
- Införande av DNA kan i vissa fall integreras slumpmässigt i genomet och orsaka insertionella mutationer.
- RNA-baserade transfektioner (t.ex. siRNA eller mRNA) ger vanligen icke-permanenta förändringar — effekten försvinner efter några celldelningar.
- Off-target-effekter: särskilt vid RNAi eller CRISPR kan oönskade gener påverkas.
- Immunrespons: viral leverans eller vissa nukleinsyror kan aktivera immunsystemet, särskilt vid in vivo-användning.
Kontroller och verifiering
Det är viktigt att inkludera lämpliga kontroller och att verifiera effektiviteten:
- Positiv kontroll (t.ex. plasmid som uttrycker GFP) för att bedöma transfectionseffektivitet.
- Negativ kontroll/”mock” (utan DNA/RNA eller med tom vektor) för att separera effekter av reagens från effekter av det införda materialet.
- Analysmetoder: fluorescensmikroskopi, flödescytometri, qPCR (mRNA-level), Western blot (protein), reporterassays eller sekvensering för att bekräfta genintegration eller redigering.
- För stabila cellinjer: antibiotikaselektion och klonval följt av validering av uttryck och genotyp.
Praktiska tips för bättre resultat
- Optimera cellkonfluens: de flesta celllinjer transfekteras bäst vid 50–80 % konfluens.
- Relation mellan reagens och nukleinsyra: titrera för att hitta den bästa balansen mellan effektivitet och låg cytotoxicitet.
- Byt medium vid behov och undvik serum under vissa transfectionessteg om rekommenderat av leverantören.
- Testa flera metoder: vissa celltyper svarar bättre på elektroporation eller viral leverans än lipider.
- Använd tekniker för att minska off-target-effekter vid RNAi/CRISPR, t.ex. flera oberoende siRNA eller noggrant designade gRNA.
Sammanfattningsvis är transfektion ett kraftfullt verktyg inom molekylärbiologi och biomedicinsk forskning för att manipulera DNA och RNA i celler. Val av metod, noggrann experimentdesign, kontroller och verifiering är avgörande för pålitliga och säkra resultat.
DNA-konstruktioner
En DNA-konstruktion är en artificiellt konstruerad bit nukleinsyra som ska "transplanteras" till en målvävnad eller cell. Den kan innehålla en DNA-insats som innehåller den gensekvens som kodar för ett intressant protein.
DNA-insatsen är hjärtat i den molekylärbiologiska vektorn. Detta är en allmän term för ett fordon som används för att överföra främmande genetiskt material till en annan cell. Transfektion av djurceller innebär vanligtvis att tillfälliga porer (hål) öppnas i cellmembranet så att cellerna kan ta upp vektorn.
Frågor och svar
F: Vad är transfektion?
S: Transfektion är processen att avsiktligt föra in DNA eller RNA i celler.
F: Hur bildas termen "transfektion"?
S: Termen "transfektion" är sammansatt av orden "transformation" och "infektion".
F: Vilka är de olika typerna av transfektion?
S: De olika typerna av transfektion omfattar: transformation av bakterieceller med virala nukleinsyror, transformation av djurceller i vävnadskultur med renat DNA, transformation av celler eller embryon med enkel- eller dubbelsträngat RNA samt genterapi med hjälp av ett modifierat virus som vektor.
F: Vad händer när DNA tillförs cellernas genom vid transfektion?
S: När DNA tillförs cellernas genom under transfektionen kan det leda till att vissa proteiner byggs upp eller att vissa gener tystas.
F: Kan förändringar som åstadkoms genom transfektion med RNA-molekyler överföras permanent i en linje av celler?
S: Nej, förändringar som åstadkommits genom transfektion med RNA-molekyler kan inte permanent överföras i en cellinje.
F: Vad kan transfektion leda till?
S: Transfektion kan leda till oväntade morfologier och abnormiteter i målcellerna.
F: Vad är syftet med genterapi som använder ett modifierat virus som vektor?
S: Syftet med genterapi med ett modifierat virus som vektor är att föra in nya, funktionella gener i arvsmassan hos en individ med en genetisk sjukdom, i hopp om att korrigera eller behandla sjukdomen.
Sök