Tunnskiktskromatografi (TLC) – principer, utrustning och tillämpningar

Tunnskiktskromatografi (TLC) – lär dig principer, utrustning och praktiska tillämpningar för effektiv separation och analys av kemiska blandningar i laboratoriet.

Tunnskiktskromatografi (eller TLC) är en snabb och enkel kromatografimetod för att separera och analysera blandningar i sina enskilda beståndsdelar. Metoden bygger på olikheter i ämnens affinitet till en stationär fas och en mobil fas, vilket gör att komponenterna rör sig olika långt på en platta och därmed separeras.

Principer

En TLC-platta består av ett tunt skikt av ett fast material (den stationära fasen) på ett underlag. Många vanliga plattor har ett lager av kiseldioxid (silika) bundet till glas eller plast. När en lämplig lösningsmedelsblandning (den mobila fasen) rör sig uppåt över skiktet med hjälp av kapillärkraften, kommer ämnen i ett prov att fördelas mellan den stationära och den mobila fasen beroende på deras polaritet och andra interaktioner. Ämnen som har större affinitet för den mobila fasen följer med lösningsmedlet längre, medan de som binder starkare till den stationära fasen vandrar kortare sträckor.

Utrustning och material

• TLC-plattor: kommersiella plattor med silikagel, alumina eller modifierade ytor (t.ex. C18 för omvänd fas). Finns i olika storlekar och tjocklekar; preparativa plattor har tjockare skikt för isolering.
• Utvecklingskammare: glas- eller plastbehållare med lock. Kan användas med eller utan mättning (saturering) av kammaren med mobil fasånga.
• Provtillämpningsverktyg: mikropipetter, kapillärpipetter eller spotsningsverktyg för att applicera små volymer på plattan.
• Utslagning/display: UV-lampa (254 nm eller 365 nm), färgningsreagenser (t.ex. natriumsulfat, jod, ninhydrin) och värmeplatta eller ugn för framkallning.
• Andra hjälpmedel: linjal för att markera startlinje och lösningsmedelsfront, blyertspenna (inte tusch), kameraplattform eller dokumentationssystem.

Procedur — steg för steg

• Markera en tunn startlinje cirka 1 cm från plattans nedre kant med en blyertspenna.
• Applicera provet som en liten punkt eller band på startlinjen. Använd små volymer för skarpa band.
• Förbered utvecklingskammaren med ett tunt lager av mobil fas (lösningsmedel) i botten. Fyll inte för högt—lösningsmedlet får inte täcka startlinjen.
• Om rekommenderat, mätta kammaren genom att placera en filter- eller pappersremsa fuktad med mobil fas i kammaren för jämn förångning.
• Ställ plattan vertikalt i kammaren så att den nedre kanten nuddar mobilfasen. Sätt på locket och låt lösningsmedlet vandra upp till ca 0.5–1 cm från plattans övre kant.
• Ta ut plattan, markera lösningsmedelsfronten omedelbart och låt plattan torka.
• Visualisera fläckarna under UV eller genom att behandla med lämpligt färgningsreagens. Dokumentera resultatet, t.ex. med foto.

Visualisering och detektion

Vissa föreningar är synliga i UV-ljus (ofta vid 254 eller 365 nm) medan andra kräver kemisk framkallning:

• UV-ljus: många aromatiska eller konjugerade system kvävs eller absorberar UV och syns som mörka eller fluorescerande band.
• Iodkammare: jodångor ger temporära bruna fläckar på många organiska molekyler.
• Ninhydrin: används för att upptäcka aminosyror och aminoföreningar (ger violett/gult färgkomplex).
• Kristalliserande reagenser: t.ex. anisaldehyd, vanillin eller kaliumpermanganat för specifika funktionella grupper.

Beräkning av Rf-värde

Retention factor (Rf) är ett mått på hur långt en komponent vandrat i förhållande till mobilfas-fronten. Beräknas som:

Rf = avstånd från startlinje till komponentens mitt / avstånd från startlinje till lösningsmedelsfront

Rf-värden är beroende av val av mobil fas, typ av platta och körningsförhållanden — de är därför användbara för jämförelser under samma betingelser men inte absolutbestämning över olika metoder.

Varianter och anpassningar

• Normal fas-TLC: vanligast, med polärt stationärt skikt (t.ex. silikagel) och mindre polar mobil fas (hexan/etanol, hexan/EtOAc).
• Omvänd fas-TLC: mindre polar stationär fas (t.ex. C18), används med polära mobilfaser (vatten/metanol eller vatten/acetonitril).
• Preparativ TLC (prep-TLC): tjockare skikt och större plattor för att isolera och återvinna större mängder föreningar.
• 2-dimensionell TLC: plattan utvecklas i en riktning med ett lösningsmedel, sedan roteras 90° och utvecklas med ett annat lösningsmedel för bättre separation av komplexa blandningar.

Tillämpningar

• Snabb kontroll av reaktionsförlopp i organisk syntes.
• Identifiering av komponenter i blandningar och jämförelse med standarder.
• Rening och isolering av små mängder med preparativ TLC.
• Kvalitetskontroll inom läkemedel, naturprodukter och livsmedelsanalys.
• Undervisning och träning i kromatografiska tekniker.

Fördelar och begränsningar

• Fördelar: snabb, billig, kräver små mängder prov, enkel att utföra och ger visuell feedback.
• Begränsningar: begränsad upplösning för mycket komplexa blandningar, inte kvantitativ utan vidare behandling, svårare att reproducera exakt mellan olika laboratorier om inte standardiserat protokoll används.

Praktiska tips och felsökning

• Applicera provet som en så liten och koncentrerad punkt som möjligt för skarpare band.
• Använd rätt lösningsmedelsblandning—om komponenterna vandrar för lite, använd ett mer polärt lösningsmedel (för normal fas) och vice versa.
• Satsa på jämn kammarklimat (saturation) för reproducerbara förhållanden, särskilt vid känsliga Rf-variationer.
• Om två band ligger mycket nära varandra, prova 2D-TLC eller ändra mobilfasens sammansättning.
• Undvik att skriva med bläck på plattan; pennstreck kan lösa upp sig och störa separationen.

Säkerhet och avfallshantering

Använd lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, skyddsglasögon och dräkt). Många vanliga lösningsmedel (hexan, acetonitril, etylacetat) är brandfarliga och/eller giftiga—arbeta i dragskåp. Avfall med lösningsmedel och använda färgningsreagenser ska tas omhand enligt lokala föreskrifter och laboratoriepolicy.

Genom att förstå dessa grundprinciper och tillämpa god laboratoriepraxis kan TLC vara en mycket effektiv metod för snabb screening, analys och småskalig rening i både forskning och undervisning.

Sök med bokstav