En kofaktor (eller kofaktor) är en kemisk förening som inte är ett protein, men som är knuten till ett protein. Föreningen behövs för proteinets biologiska aktivitet. I de flesta fall är proteinet ett enzym och kofaktorn hjälper enzymet att fungera. Om så är fallet kallas kofaktorerna också för koenzymer.

Cofaktorer som är komplexa organiska molekyler kallas ofta koenzymer. Om de är förbundna med en kovalent bindning är de en prostetisk grupp. Men om de bara är tillfälligt sammankopplade är kofaktorn ett kosubstrat.

Vissa enzymer behöver flera kofaktorer. Organiska kofaktorer är ofta vitaminer eller tillverkade av vitaminer. Metalljoner är ofta kofaktorer, men många kofaktorer har både oorganiska och organiska delar.