En kolorimeter är en anordning som används för att mäta färger, eller kolorimetri. Den mäter absorbansen av olika våglängder av ljus i en lösning. Den kan användas för att mäta koncentrationen av en känd lösta substans.

Olika kemiska ämnen absorberar olika våglängder av ljus. När koncentrationen av den lösta substansen är högre absorberar den mer ljus i en viss våglängd. Detta kallas Beer-Lambert-lagen.

Vad som mäts: transmittans och absorbans

Instrumentet skickar ljus genom en cuvett med provlösning. Mätvärdet kan anges som transmittans (T) eller absorbans (A).

  • Transmittans T = I / I0, där I0 är infallande ljusintensitet och I är det ljus som passerar provet.
  • Absorbans A = −log10(T). Absorbans är proportionell mot mängden absorberande ämne under förutsättningar där Beer–Lambert-lagen gäller.

Beer–Lambert-lagen (kvantitativt samband)

Beer–Lambert-lagen uttrycks vanligtvis som:

A = ε · c · l

  • ε är molar extinktionskoefficient (molar absorptivitet), en egenskap hos den absorberande substansen (enhet L·mol−1·cm−1).
  • c är koncentrationen av ämnet (mol·L−1).
  • l är ljusets vägsträcka genom provet (cm), alltså cuvettens ljusväg.

Om ε och l är kända går det direkt att beräkna c från en uppmätt absorbans A. Alternativt används kalibreringskurva (absorbans vs koncentration) för ämnen där ε inte är känt eller där matrisen påverkar mätningen.

Praktiskt förfarande vid koncentrationsbestämning

  • Välj lämplig våglängd (vanligtvis där ämnet har ett absorbansmaximum).
  • Gör en blindmätning (blank) med lösningsmedlet för att nollställa instrumentet.
  • Bered standardlösningar med kända koncentrationer och mät deras absorbans.
  • Plotta absorbans mot koncentration och bestäm lutningen (kalibreringskurva). Kontrollera att linjäritet råder inom intressanta intervall.
  • Mät absorbansen hos okända prover och använd kalibreringskurvan eller Beer–Lambert-lagen för att beräkna koncentrationen.

Typer av instrument och komponenter

  • Enkelvåglängdskolorimeter använder en specifik ljuskälla och filter/LED för en bestämd våglängd.
  • Spektrofotometer kan skanna över flera våglängder med monochromator och ger absorptionsspektrum.
  • Enkelstråle vs dubbelstråle: dubbelstråle jämför prov och referens i realtid och kompenserar för fluktuationer i ljuskällan.
  • Detektorerna kan vara fotodioder eller fotomultipliers beroende på känslighetskrav.
  • Cuvetter: vanligtvis glas eller kvarts (kvarts används för UV-mätningar under ~340 nm). Ljudlig vägsträcka är ofta 1 cm, men andra längder finns.

Begränsningar och orsaker till avvikelse från lagen

  • Hög koncentration: många system blir icke-linjära vid höga koncentrationer pga. molekylära interaktioner eller refraktionsindexändringar.
  • Ströljus och monochromatisitet: polykromatiskt ljus eller mycket spritt ljus ger avvikelser.
  • Partiklar eller turbidity (spridning) ger falskt hög absorbans (ljuset sprids bort från detektorn).
  • Kemiska equilibrium och reaktioner: om provet reagerar under mätning eller ändrar form påverkas ε.
  • Instrumentell felkälla: smutsiga cuvetter, felaktig nollställning, felaktig våglängdskalibrering eller lampans åldrande.

Exempel på användningsområden

  • Bestämning av nukleinsyror: DNA och RNA mäts ofta vid 260 nm.
  • Proteiner: aromatiska aminosyror har absorbans runt 280 nm; färgreaktioner (t.ex. Bradford, Lowry) mäts vid synliga våglängder.
  • Enzymkinetik och reaktionstitreringar: följa förändring i absorbans över tid för att bestämma aktivitetsparametrar.
  • Miljöanalyser: mätning av färg eller föroreningar i vattenprover.

Rutiner, tips och säkerhet

  • Använd alltid en blank med samma lösningsmedel som proverna.
  • Skölj och torka cuvetterna noggrant; repor och fingeravtryck påverkar mätningarna.
  • Använd lämplig cuvett (kvarts för UV). Kontrollera att cuvetten är ordentligt centrerad i hållaren.
  • Mät flera replikat för statistisk säkerhet och kontrollera att värden ligger inom instrumentets linjära område.
  • Vid beräkningar: håll enhetssystemet konsekvent (ε i L·mol−1·cm−1, c i mol·L−1, l i cm).
  • Följ laboratoriets säkerhetsrutiner för kemikalier och avfallshantering.

Felsökning

Om mätningar är ovanligt brusiga eller systematiskt felaktiga, kontrollera:

  • Om instrumentet är korrekt nollställt med blanken.
  • Om lampan behöver bytas eller om monochromatorn är felinställd.
  • Om cuvetterna är rena, oskadade och matcher varandra (särskilt vid jämförande mätningar).
  • Om provet innehåller partiklar eller luftbubblor som kan ge spridning.

Sammanfattningsvis är en kolorimeter eller spektrofotometer ett ovärderligt verktyg för kvantitativa bestämningar i kemi och biologi, förutsatt att instrumentet används korrekt och begränsningarna i Beer–Lambert-lagen beaktas.