Riktad evolution
Riktad evolution (DE) är en metod som används för att framställa enzymer för industriella eller medicinska ändamål.
Metoden är proteinteknik som efterliknar det naturliga urvalet.
Den grundläggande idén är att en gen genomgår upprepade omgångar av mutationer för att skapa ett bibliotek av varianter. Genom urval isoleras gener med den önskade funktionen. De utgör en mall för nästa omgång.
Detta kan göras in vivo (i levande celler av bakterier eller jäst) eller in vitro (fritt i lösning eller mikrodroppar).
Genom att testa fler mutanter ökar chansen att hitta en mutant med de önskade egenskaperna.
Under evolutionen in vivo transformeras varje cell (vanligtvis bakterier eller jäst) med en plasmid som innehåller en annan medlem av variantbiblioteket. Endast den intressanta genen skiljer sig åt mellan cellerna, medan alla andra gener förblir desamma.
Cellerna uttrycker proteinet antingen i cytoplasman eller på ytan där dess funktion kan testas. Detta format har fördelen att man kan selektera för egenskaper i en cellulär miljö, vilket är användbart när det utvecklade proteinet eller RNA:t ska användas i levande organismer.
När DE görs utan celler används transkription och översättning in vitro för att producera proteiner eller RNA fritt i lösning eller i konstgjorda mikrodroppar. Fördelen med detta är att det finns fler villkor (t.ex. temperatur, lösningsmedel). Det kan uttrycka proteiner som skulle vara giftiga för celler. Dessutom kan experiment med in vitro-evolution generera mycket större bibliotek (upp till 1015) eftersom biblioteks-DNA:t inte behöver införas i cellerna. Detta begränsar ofta vad som kan göras.
Ett exempel på riktad evolution i jämförelse med naturlig evolution. Den inre cykeln visar de tre stegen i den riktade evolutionen med den efterliknade naturliga processen inom parentes. Den yttre cirkeln visar stegen i ett typiskt experiment. De röda symbolerna anger funktionella varianter, de bleka symbolerna anger varianter med reducerad funktion.
Säkerställande av ärftlighet
När funktionella proteiner har isolerats är det nödvändigt att deras gener också är det, och därför krävs en koppling mellan genotyp och fenotyp.
Detta kan vara kovalent, där mRNA-genen kopplas till proteinet i slutet av översättningen med puromycin.
Alternativt kan proteinet och dess gen förvaras tillsammans eller i emulsionsdroppar. De isolerade gensekvenserna multipliceras sedan genom PCR eller genom transformerade värdbakterier. Antingen den bästa sekvensen eller en pool av sekvenser kan användas som mall för nästa mutageneserunda. De upprepade cyklerna diversifiering-selektion-amplifiering skapar enzymvariationer som är anpassade till selektionsprocessen.
Ett uttryckt protein kan vara kovalent kopplat till sin gen (som i mRNA), till vänster, eller placeras i samma fack som genen, till höger. I båda fallen isoleras den gen som kodar för proteinet.
Utdelat pris
Den amerikanska ingenjören Frances Arnold har vunnit Millenniumpriset för teknik för sin pionjärverksamhet inom riktad evolution.
Frågor och svar
F: Vad är riktad utveckling?
S: Riktad evolution (DE) är en metod som används för att framställa enzymer för industriella eller medicinska ändamål. Det är en form av proteinteknik som efterliknar det naturliga urvalet.
F: Hur fungerar riktad evolution?
Svar: Riktad evolution fungerar genom att en gen genomgår upprepade omgångar av mutationer, vilket skapar ett bibliotek av varianter. Urvalet isolerar sedan gener med önskad funktion, som sedan används som mallar för nästa omgång.
F: Var kan riktad evolution utföras?
S: Riktad evolution kan göras in vivo (i levande celler av bakterier eller jäst) eller in vitro (fritt i lösning eller mikrodroppar).
F: Vilka är fördelarna med riktad evolution in vivo?
S: Att göra riktad evolution in vivo har fördelen att man kan välja egenskaper i en cellulär miljö, vilket är användbart när det utvecklade proteinet eller RNA:t ska användas i levande organismer.
Fråga: Vilka är fördelarna med riktad evolution in vitro?
S: Riktat evolution in vitro har fördelen att det finns fler villkor (t.ex. temperatur, lösningsmedel) och att det går att uttrycka proteiner som skulle vara giftiga för cellerna. Dessutom kan man generera mycket större bibliotek eftersom DNA inte behöver införas i cellerna.
F: Vad begränsar vad som kan göras under ett in vitro-experiment?
S: Storleksgränsen för vad som kan göras under ett in vitro-experiment bestäms ofta av hur mycket DNA som måste föras in i cellerna.
