År 539 f.v.t. föll det nybabyloniska riket för Cyrus den store,
Persiens kung, i slaget vid Opis. Babylons murar var mycket höga och mycket tjocka. Den enda vägen in i staden var genom en av de många portarna. Eufrat flödade intill murarna och Cyrus bestämde sig för att använda floden för att ta sig in i staden. Cyrus' trupper ledde om Eufratfloden. Detta fick flodens nivå att sjunka vilket gjorde att soldaterna kunde ta sig in i staden.
Babylonierna hade hållit en fest på kvällen. Den persiska armén tog över större delen av staden innan babylonierna hade fått reda på att perserna hade tagit sig in i staden. Berättelsen rapporterades av Herodotos och omnämns även i den hebreiska Bibeln. Cyrus intog staden genom att gå genom Babylons portar utan något eller mycket lite motstånd från de berusade babylonierna.
Cyrus utfärdade senare ett dekret som tillät människor, inklusive judarna, att återvända till sitt eget land. Detta nämns i Gamla testamentet. Det gjorde det möjligt att återuppbygga judarnas tempel i Jerusalem.
Under Cyrus och den efterföljande persiska kungen Darius den store blev Babylon huvudstad i det nionde satrapen (Babylonien i söder och Athura i norr). Det var ett centrum för lärande och vetenskapliga framsteg. I det akemenidiska Persien återupplivades de babyloniska konsterna astronomi och matematik. Babyloniska lärda gjorde kartor över konstellationer. Staden var det persiska imperiets administrativa huvudstad. Detta imperium var det mäktigaste i den då kända världen. Många viktiga arkeologiska upptäckter har gjorts som förbättrar vår förståelse av den tiden.
De tidiga persiska kungarna hade försökt bevara Marduks religiösa ceremonier. Under Dareios III:s regeringstid hade överbeskattning och många krig lett till att Babylons viktigaste helgedomar och kanaler hade försämrats och till att regionen upplöstes. Trots tre uppror 522 f.Kr., 521 f.Kr. och 482 f.Kr. förblev Babylons land och stad under persiskt styre i två århundraden. År 331 före Kristus tog Alexander den store över. Under det parthiska riket fortsatte Babylon att krympa och förlora i betydelse.