Zinkfingernukleaser (ZFN): Vad de är och hur de används i genredigering

Zinkfingernukleaser (ZFN): lär dig hur ZFN fungerar i genredigering — mål-DNA, precisa DNA‑klipp, reparationer, tillämpningar, fördelar och risker.

Författare: Leandro Alegsa

Zinkfingernukleaser (ZFN) är ett verktyg som används för att rikta in sig på gener och ändra DNA. Det är en av tre metoder för att ändra genomet med konstruerade nukleaser.

De består av två delar. Zinkfingrar är konstgjorda molekyler som består av ett protein och zink. Var och en binder sig till ett specifikt DNA. Zinkfingernukleaser (ZFN) är enzymer som framställs genom att man fogar ihop ett zinkfinger med ett DNA-klyvningsenzym som kallas Fokl. ZFN binder alltså till en specifik DNA-sekvens och klipper den sedan på två ställen. Vanliga cellenzymer klistrar ihop ändarna, minus den bit som klippts bort (DNA-reparation).

Varje ZFN är avsedd att användas på en enda gen som kallas "målgen" eller "mål-DNA". De kan utformas så att de fungerar på specifika delar av gener för att skapa en önskad förändring. De två typerna av DNA-förändringar är mutationer, t.ex. deletioner och infogningar. Genetisk forskning tittar på muterade djurförsökspersoner för att ta reda på vad den särskilda genen gör.

Hur ZFN fungerar — mekanism kortfattat

Zinkfingerproteinet består av flera upprepade motiver där varje zinkfinger vanligtvis känner igen cirka 3 baspar i DNA. Genom att kombinera flera zinkfingrar byggs en skräddarsydd bindningsdomän som kan känna igen en längre, unik DNA-sekvens. Därefter kopplas denna bindningsdomän till en FokI-klyvare (enzymet som klyver DNA). FokI fungerar som ett dimeriserande endonukleas — det måste bilda ett par (två FokI) för att skära DNA.

För att skapa ett dubbelsträngsbrott designas två ZFN-molekyler som binder på intilliggande DNA-sekvenser på motsatta strängar. När båda sitter på plats dimeriserar FokI-domänerna och gör ett precist snitt. Cellen reparerar sedan brottet med dess egna reparationsvägar, vilket leder till förändringar i mål-DNA:t.

DNA-reparationsvägar och vad de ger för resultat

  • Non-homologous end joining (NHEJ): Snabb men felbenägen reparation som ofta resulterar i indels (insertioner eller deletioner). Det här används för att slå ut en gen genom att introducera ramar som ger för tidiga stoppkodon.
  • Homology-directed repair (HDR): Om en mall-DNA (donator) finns kan cellen använda den för exakt reparation och infoga ny genetisk information. HDR är användbart vid korrigeringar eller införande av nya transgener, men fungerar bäst i celler som är i delningsfas.

Tillämpningar

  • Grundforskning: ZFN används för att skapa genetiska "knockout"-modeller i celler och djur för att studera genfunktion.
  • Gene therapy: Kliniska försök har använt ZFN för att modifiera patientceller ex vivo (t.ex. T‑celler eller hematopoetiska stamceller) innan återinförande — ett exempel är försök att slå ut CCR5 för att göra celler motståndskraftiga mot HIV.
  • Jordbruk och bioteknik: Genredigering av grödor för önskade egenskaper som sjukdomsresistens eller förbättrad näringsprofil.
  • Industriella tillämpningar: Modifiering av mikroorganismer för produktion av läkemedel, enzymer eller biokemikalier.

Fördelar och begränsningar

  • Fördelar: ZFN kan uppnå hög specificitet när de är väl designade, och tekniken har en lång klinisk utvecklingshistorik jämfört med vissa nyare verktyg.
  • Begränsningar: Konstruktion av zinkfingerbindningsdomäner är tekniskt krävande och kan kräva mycket optimering; bindningsspecificiteten är kontextberoende (ett finger påverkas av intilliggande fingrar). Off-target-klyvningar och celltoxisk respons kan förekomma.

Jämförelse med andra genredigeringsverktyg

Det finns två andra stora plattformar för riktade nukleaser: TALEN och CRISPR-Cas. Kortfattat:

  • TALEN: Likt ZFN består av en skräddarsydd DNA-bindande protein-domän kopplad till FokI. TALEN är ofta lättare att designa än zinkfingrar men också relativt stora molekyler.
  • CRISPR-Cas: Använder en guidande RNA för att hitta målsekvensen, vilket gör omprogrammering mycket enklare och billigare. CRISPR har blivit dominerande i många forskningssammanhang, men ZFN och TALEN kan i vissa fall ge bättre specifikitet eller undvika immunologiska problem mot Cas-proteiner.

Leveransmetoder

ZFN kan levereras på flera sätt beroende på applikation:

  • Plasmider som kodar för zinkfingerproteiner och FokI
  • mRNA som översätts i cellen
  • Proteinkomplex (RNP — ribonukleas/protein i fallet med CRISPR, men motsvarande för ZFN innebär färdigproducerade proteiner)
  • Virala vektorer (t.ex. adenovirus eller lentivirus) för in vivo- eller ex vivo-transduktion

Säkerhet, off-target-effekter och etik

  • Off-target-klyvningar: Oavsiktliga snitt på andra platser i genomet kan leda till mutationer eller celltoxicitet. Noggrann design och omfattande sekvenseringskontroller krävs för att kartlägga dessa effekter.
  • Immunrespons: Leverans av proteiner eller virus kan trigga immunsvar, särskilt vid in vivo-behandlingar.
  • Etiska aspekter: Genredigering i somatiska celler för behandling skiljer sig etiskt från ärftiga (könscells) ändringar. Reglering och ansvar krävs, särskilt för kliniska prövningar och eventuella terapeutiska tillämpningar.

Historik och nuvarande status

ZFN var ett av de första praktiska verktygen för riktad genmodifiering och har bidragit till tidiga framsteg inom både grundforskning och kliniska försök. Sedan framväxten av CRISPR-Cas-systemet har ZFN i många forskningsmiljöer ersatts av enklare och billigare metoder, men ZFN används fortfarande i vissa kliniska och industriella sammanhang där dess egenskaper är fördelaktiga.

Slutsats

Zinkfingernukleaser är ett kraftfullt men tekniskt krävande verktyg för preciserad genredigering. De fungerar genom specifik DNA-bindning och FokI-medierad klyvning, och utnyttjar cellens reparationsmekanismer för att åstadkomma mutationer eller insättningar. Valet att använda ZFN beror på mål, krav på specificitet, tillgängliga resurser och alternativa tekniker som TALEN eller CRISPR.

3-D representation av en zinkfingermolekyl. Zinkfingrarna är blå och zinkjonen är grön.Zoom
3-D representation av en zinkfingermolekyl. Zinkfingrarna är blå och zinkjonen är grön.

Zinkfingers struktur

Zinkfinger är namnet på många proteinstrukturer. Zinkatomen binder proteinerna och gör dem stabilare. ZFN:er binder till DNA-baspar. Ett zinkfinger kan binda cirka 3 baspar i sig själv.

ZFN-funktion

Zinkfingernukleaser består av 3-6 zinkfingrar. ZFNs har två viktiga domäner: en DNA-bindande domän och en DNA-spaltningsdomän. I DNA-spaltningsdomänen används ett enzym som kallas Fokl och som bryter sönder DNA.

ZFN:er kan endast ändra DNA-sekvenser som de är avsedda för. Den DNA-bindande domänen binder till en specifik DNA-sekvens. Två ZFN:er som är utformade för samma DNA-sekvens behövs för att ändra en gen. De DNA-bindande domänerna binder till båda strängarna i DNA:s dubbelhelix. DNA-spaltningsdomäner bryter DNA-strängen och skär ut basparen i genen. Cellerna reparerar trasiga DNA-strängar på egen hand med hjälp av DNA-reparation. Deletionsmutationer beror på att baspar saknas efter DNA-reparation.

Längden på målgensekvensen kan också anges. Minst 9 baspar kan ändras med hjälp av 3 zinkfingrar. Detta är användbart för att ta bort och infoga mycket korta DNA-sekvenser och bestämma deras effekt på målgenen. Även stora sekvenser kan ändras med hjälp av mer än en ZFN.

Användning av ZFN

ZFN:er har använts för att upptäcka genfunktioner i många genetiska studier. ZFN:er kan användas för att ändra DNA hos alla arter. En annan egenskap hos ZFNs är att de kan användas in vivo (i levande organismer). De används för närvarande på modellorganismer: växter, insekter och fiskar.

En förteckning över organismer som är involverade i forskning om genförändringar med ZFN omfattar följande:

Problem vid användning av ZFN:er

Det största problemet med ZFN:er är att oavsiktligt ändra gener utöver målgenen. En ZFN måste göras för att hitta rätt baspar på målgenen. Dessa baspar väljs så att endast målgenen kommer att ha dem. DNA-spaltningsdomäner fungerar på vilken DNA-sekvens som helst, så om man binder sig till en felaktig gensekvens kommer den att ändras i stället. ZFN:er som slår ut baspar för mer än en gen anses inte vara korrekta.

Frågor och svar

F: Vad är zinkfingernukleaser eller ZFN?


S: Zinkfingernukleaser eller ZFN är ett verktyg som används för att rikta in sig på gener och ändra DNA.

F: Vilka är de tre metoderna för att förändra arvsmassan med konstruerade nukleaser?


S: Zinkfingernukleaser eller ZFN, TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) och CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) är de tre metoderna för att förändra arvsmassan med hjälp av konstruerade nukleaser.

F: Vad är zinkfingrar?


S: Zinkfingrar är konstgjorda molekyler som består av ett protein och zink och som binder till ett specifikt DNA.

F: Vad är zinkfingernukleaser (ZFN)?


S: Zinkfingernukleaser (ZFN) är enzymer som bildas genom att ett zinkfinger fusioneras med ett DNA-klyvningsenzym som kallas Fokl.

F: Vad händer när ZFN binder till en specifik DNA-sekvens?


S: När ZFN binder till en specifik DNA-sekvens klipper den av den på två ställen.

F: Vad gör vanliga cellenzymer efter att DNA:t klippts ut?


S: Vanliga cellenzymer klibbar ihop ändarna, minus den bit som klippts bort (DNA-reparation).

F: Vilka är de två typer av DNA-förändringar som zinkfingernukleaser eller ZFN kan göra?


S: Zinkfingernukleaser eller ZFN kan göra två typer av DNA-förändringar: mutationer såsom deletioner och insertioner.


Sök
AlegsaOnline.com - 2020 / 2025 - License CC3