Gaskromatografi-masspektrometri

Historia

De första forskningsartiklarna om gas-vätskekromatografi publicerades 1950. Kemister använde olika detektorer för att se att föreningar flödade ut ur kromatografens ände. De flesta av detektorerna förstörde föreningarna, eftersom de brände dem eller joniserade dem. Dessa detektorer gjorde att kemisterna fick gissa sig till den exakta identiteten av varje förening i provet. På 1950-talet utvecklade Roland Gohlke och Fred McLafferty en ny kombinerad maskin. De använde en masspektrometer som detektor i gaskromatografi. Dessa tidiga apparater var stora, bräckliga och ursprungligen begränsade till laboratoriemiljöer.

Konstruktionen var komplex. Det var svårt att kontrollera tidsintervallet mellan olika föreningar som flödar ut ur kromatografen. Masspektrometern var alltså tvungen att arbeta färdigt med en förening innan nästa förening flödade ut ur kromatografen. I de tidiga modellerna registrerades mätningarna från masspektrometern på diagrampapper. Högutbildade kemister studerade topparnas mönster för att identifiera varje förening. På 1970-talet kompletterades masspektrometrarna med analog-till-digital-omvandlare. Detta gjorde det möjligt för datorer att lagra och tolka resultaten. I takt med att datorerna blev snabbare och mindre blev GC-MS snabbare och spreds från laboratorier till vardagen. Idag används datoriserade GC-MS-instrument i stor utsträckning för miljöövervakning av vatten, luft och jord. De används också vid reglering av jordbruk, livsmedelssäkerhet och vid upptäckt och produktion av läkemedel.

Utvecklingen av små datorer har bidragit till att förenkla GC-MS-maskinerna. Den har också kraftigt minskat den tid det tar att analysera ett prov. Electronic Associates, Inc. (EAI) var en ledande amerikansk leverantör av analoga datorer. År 1964 påbörjade EAI utvecklingen av en datorstyrd masspektrometer under ledning av Robert E. Finnigan. År 1966 såldes över 500 gasanalysatorinstrument. År 1967 bildades Finnigan Instrument Corporation (FIC). I början av 1968 levererade man den första prototypen av de fyrpoliga GC-MS-instrumenten till Stanford och Purdue University. FIC bytte så småningom namn till Finnigan Corporation och fortsatte att etablera sig som världsledande inom GC-MS-system.

Grundläggande funktion

GC-MS kan hitta alla föreningar som är blandade i ett provobjekt. Operatören löser upp provet i en vätska. Operatören injicerar sedan vätskan i en gasström. (Helium-, väte- eller kvävegas används oftast.) Gasen strömmar genom ett rör med en speciell beläggning. Eftersom varje förening i provet fäster vid beläggningen på olika sätt kommer varje förening ut ur röret vid olika tidpunkter. Beläggningen används alltså för att separera varje förening som blandades ihop i provet. När varje förening kommer ut i slutet av röret joniseras den och får en elektrisk laddning. De flesta föreningar bryts sönder när de joniseras. De olika bitarna flyger under en magnet som separerar bitarna utifrån deras vikt och laddning. En dator mäter sedan alla bitar av varje förening. Genom att jämföra mätningarna med ett datorbibliotek med kända föreningar gör datorn en lista med namnen på alla föreningar i provet. Datorn kan också ange hur mycket av varje förening som fanns i provet.

Instrumentering

GC-MS består av två stora byggstenar: gaskromatografen och masspektrometern. Gaskromatografen använder en kapillärkolonn som beror på kolonnens dimensioner (längd, diameter, filmtjocklek) och fasens egenskaper (t.ex. 5 % fenylpolysiloxan). Skillnaden i de kemiska egenskaperna mellan olika molekyler i en blandning kommer att separera molekylerna när provet färdas längs kolonnens längd. Molekylerna tar olika lång tid (kallad retentionstid) på sig för att komma ut ur (eluera från) gaskromatografen. Detta gör det möjligt för masspektrometern nedströms att fånga, jonisera, accelerera, avleda och detektera de joniserade molekylerna separat. Masspektrometern gör detta genom att dela upp varje molekyl i joniserade fragment och upptäcka dessa fragment med hjälp av deras massa- och laddningsförhållande.

När dessa två maskiner används tillsammans kan man identifiera ämnena med mycket högre precision än om de används var för sig. Det är inte möjligt att göra en exakt identifiering av en viss molekyl med enbart gaskromatografi eller masspektrometri. Masspektrometriprocessen kräver normalt ett mycket rent prov. Tidigare har gaskromatografin använt andra detektorer, t.ex. en flamjoniseringsdetektor. Dessa detektorer kan inte separera olika molekyler som råkar ta lika lång tid på sig att färdas genom kolonnen. (När två olika molekyler har samma retentionstid sägs de "samelutera"). De sameluterande molekylerna kommer att förvirra datorprogrammen som läser ett enda masspektrum för båda molekylerna.

Ibland kan två olika molekyler också ha ett liknande mönster av joniserade fragment i en masspektrometer (masspektrum). Genom att kombinera de två processerna minskar risken för fel. Det är ytterst osannolikt att två olika molekyler beter sig på samma sätt i både en gaskromatograf och en masspektrometer. Om ett masspektrum matchar den aktuella analyten kan därför retentionstiden för detta spektrum kontrolleras mot en karakteristisk GC-retentionstid för att öka säkerheten att analyten finns i provet.

Typer av detektorer för masspektrometrar

Den vanligaste typen av MS som är kopplad till en GC är en fyrpolig masspektrometer. Hewlett-Packard (numera Agilent) saluför den under handelsnamnet "Mass Selective Detector" (MSD). En annan relativt vanlig detektor är masspektrometern med jonfälla. Dessutom kan man hitta en masspektrometer med magnetisk sektor. Dessa instrument är dock dyra och skrymmande och förekommer vanligtvis inte i laboratorier med hög kapacitet. Andra detektorer används, t.ex. TOF (time of flight), tandemquadrupoler (MS-MS) (se nedan), eller i fallet med en jonfälla-MS ⁿ. n anger antalet masspektrometri-steg.

GC-MS:s insida, med gaskromatografens kolonn i ugnen till höger.


Schematisk GC-MS-skiss

Analys

En masspektrometer används vanligtvis på ett av två sätt: Full Scan eller selektiv jonövervakning (SIM). Den typiska GC-MS kan arbeta på ettdera sättet eller på båda samtidigt.

Fullständig genomsökning MS

Vid insamling av data i läget för fullständig skanning väljs ett målområde av massfragment ut och läggs in i instrumentets metod. Ett exempel på ett typiskt brett område av massfragment som skall övervakas är m/z 50 till m/z 400. Vilken serie som skall användas bestäms till stor del av vad man förväntar sig att det finns i provet, samtidigt som man är medveten om lösningsmedlet och andra möjliga interferenser. Om en MS söker efter massfragment med mycket låga m/z kan den upptäcka luft eller andra möjliga störande faktorer. Om man använder ett stort skanningsområde minskar instrumentets känslighet. Maskinen kommer att utföra färre skanningar per sekund eftersom varje skanning tar längre tid att upptäcka ett större intervall av massfragment.

Full scan är användbart för att bestämma okända föreningar i ett prov. Den ger mer information än SIM när det gäller att bekräfta eller lösa upp föreningar i ett prov. De flesta instrument styrs av en dator som kör ett datorprogram som kallas "instrumentmetod". Instrumentmetoden styr temperaturen i GC:n, MS-scanningshastigheten och intervallet för de fragmentstorlekar som detekteras. När en kemist utvecklar en instrumentmetod skickar kemisten testlösningar genom GS-MS i fullt skanningsläge. På så sätt kontrolleras GC-retentionstiden och massfragmentens fingeravtryck innan man övergår till en SIM-instrumentmetod. Specialiserade GC-MS-instrument, t.ex. sprängämnesdetektorer, har en instrumentmetod förinstallerad på fabriken.

Övervakning av utvalda joner

I SIM (Selected Ion Monitoring) fokuserar instrumentmetoden på vissa jonfragment. Endast dessa massfragment upptäcks av masspektrometern. Fördelarna med SIM är att detektionsgränsen är lägre eftersom instrumentet bara tittar på ett litet antal fragment (t.ex. tre fragment) vid varje skanning. Fler skanningar kan äga rum varje sekund. Eftersom endast ett fåtal massfragment av intresse övervakas är matrisinterferenserna vanligtvis lägre. För att öka chanserna att läsa ett positivt resultat korrekt är jonförhållandena för de olika massfragmenten jämförbara med en känd referensstandard.

Typer av jonisering

Efter att molekylerna har färdats längs kolonnen, passerat genom överföringsledningen och kommit in i masspektrometern joniseras de med olika metoder. Vanligtvis används endast en joniseringsmetod vid varje given tidpunkt. När provet har fragmenterats kommer det sedan att detekteras, vanligtvis av en elektronmultiplikatordiod. Dioden behandlar det joniserade massfragmentet som en elektrisk signal som sedan detekteras.

Kemister väljer en joniseringsteknik separat från att välja Full Scan eller SIM-övervakning.

Jonisering av elektroner

Den vanligaste typen av jonisering är elektronjonisering (EI). Molekylerna kommer in i MS (källan är en kvadrupol eller själva jonfällan i en jonfälla) där de träffas av fria elektroner som avges från en glödtråd. Detta liknar den glödtråd som finns i en vanlig glödlampa. Elektronerna träffar molekylerna, vilket gör att molekylen fragmenteras på ett karakteristiskt sätt som kan upprepas. Denna teknik för "hård jonisering" resulterar i att det skapas fler fragment med lågt massa- och laddningsförhållande (m/z). EI har få, om ens några, fragment som har en massa som ligger nära den ursprungliga molekylens massa. Kemister anser att hård jonisering innebär att man skjuter in elektroner i provmolekylerna. Däremot innebär "mjuk jonisering" att provmolekylen laddas genom att den träffas av en introducerad gas. Det molekylära fragmenteringsmönstret beror på den elektronenergi som appliceras på systemet, vanligtvis 70 eV (elektronvolt). Användningen av 70 eV hjälper till att jämföra de spektrum som genereras från testprovet med kända biblioteksspektrum. (Biblioteksspektren kan komma från programvara som tillhandahålls av tillverkaren eller programvara som utvecklats av National Institute of Standards (NIST-USA)). Programvaran söker biblioteksspektra med hjälp av en matchningsalgoritm, t.ex. sannolikhetsbaserad matchning eller punktproduktmatchning. Många standardiseringsorgan för metoder kontrollerar nu dessa algoritmer och metoder för att säkerställa deras objektivitet.

Kemisk jonisering

Vid kemisk jonisering (CI) placeras en reagensgas, vanligtvis metan eller ammoniak, i masspektrometern. Det finns två typer av CI: positiv CI och negativ CI. I båda fallen kommer reagensgasen att interagera med elektronerna och analyten och orsaka en "mjuk" jonisering av den intressanta molekylen. En mjukare jonisering fragmenterar molekylen i lägre grad än den hårda joniseringen vid EI. Kemister föredrar CI framför EI. Detta beror på att CI producerar minst ett massfragment med en vikt som är nästan lika stor som molekylvikten hos den aktuella analyten.

Positiv kemisk jonisering

Vid positiv kemisk jonisering (PCI) interagerar reagensgasen med målmolekylen, oftast med ett protonbyte. Detta ger upphov till jonarter i relativt stora mängder.

Negativ kemisk jonisering

Vid negativ kemisk jonisering (NCI) minskar reagensgasen de fria elektronernas inverkan på målanalyten. Den minskade energin gör att fragmenten vanligtvis är mycket välförsedda. (Fragmenten bryts inte upp ytterligare.)

Tolkning

Det primära målet med instrumentanalys är att mäta en mängd ämne. Detta görs genom att jämföra de relativa koncentrationerna mellan atommassorna i det genererade masspektrumet. Två typer av analyser är möjliga, jämförande och ursprungliga. Komparativ analys jämför i huvudsak det givna spektrumet med ett spektrumbibliotek för att se om dess egenskaper finns för något känt prov i biblioteket. Detta utförs bäst av en dator eftersom det finns många visuella förvrängningar som kan uppstå på grund av variationer i skalan. Datorer kan också korrelera fler data (t.ex. retentionstiderna som identifierats av GC) för att mer exakt relatera vissa data.

En annan analysmetod är att mäta topparna i förhållande till varandra. I denna metod sätts den högsta toppen till 100 %. De andra topparna får ett värde som motsvarar förhållandet mellan topphöjden och den högsta topphöjden. Alla värden över 3 % tilldelas. Den okända föreningens totala massa anges normalt av huvudtoppen. Värdet för denna huvudtopp kan användas för att passa in i en kemisk formel som innehåller de olika grundämnen som man tror ingår i föreningen. Isotopmönstret i spektrumet är unikt för grundämnen som har många isotoper. Det kan alltså också användas för att identifiera de olika grundämnena som finns. Detta ger den okända molekylens övergripande kemiska formel. Eftersom en molekyls struktur och bindningar bryts sönder på karakteristiska sätt kan de identifieras utifrån skillnaden i toppmassor. Den identifierade molekylstrukturen måste överensstämma med de egenskaper som registrerats av GC-MS. Typiskt sett görs denna identifiering automatiskt av de datorprogram som följer med instrumentet. Dessa program matchar spektren mot ett bibliotek av kända föreningar som har samma lista över grundämnen som kan finnas i provet.

En analys av hela spektrumet tar hänsyn till alla "toppar" inom ett spektrum. Selektiv jonövervakning (SIM) övervakar endast utvalda toppar som är associerade med ett visst ämne. Kemister antar att en uppsättning joner vid en viss retentionstid är karakteristiska för en viss förening. SIM är en snabb och effektiv analys. SIM fungerar bäst när analytikern har tidigare information om ett prov eller bara letar efter några få specifika ämnen. När mängden information som samlas in om jonerna i en viss gaskromatografisk topp minskar, ökar analysens känslighet. SIM-analysen gör det alltså möjligt att detektera och mäta en mindre mängd av en förening. Men graden av säkerhet om den föreningens identitet minskar.

GC-tandem MS

När en andra fas av massfragmentering läggs till, t.ex. med hjälp av en andra fyrpol i ett fyrpolinstrument, kallas det tandem MS (MS/MS). MS/MS är bra för att mäta låga nivåer av målföreningar i ett prov med en matris av bakgrundsföreningar som inte är av intresse.

Den första kvadrupolen (Q1) är ansluten till en kollisionscell (q2) och en annan kvadrupol (Q3). Båda quadrupolerna kan användas i skanningsläge eller statiskt läge, beroende på vilken typ av MS/MS-analys som används. Analystyperna omfattar skanning av produktjoner, skanning av prekursorjoner, Selected Reaction Monitoring (SRM) och skanning av neutrala förluster. Till exempel: När Q1 är i statiskt läge (man tittar på endast en massa som i SIM) och Q3 är i skanningsläge får man ett så kallat produktjonspektrum (även kallat "dotterspektrum"). Från detta spektrum kan man välja en framträdande produktjon som kan vara produktjon för den valda prekursorjonen. Paret kallas "övergång" och utgör grunden för SRM. SRM är mycket specifik och eliminerar nästan helt matrisbakgrund.

Applikationer

Miljöövervakning och sanering

Många kemister anser att GC-MS är det bästa verktyget för att övervaka organiska föroreningar i miljön. Kostnaden för GC-MS-utrustning har minskat mycket. Samtidigt har GC-MS tillförlitlighet ökat. Båda förbättringarna har ökat användningen i miljöundersökningar. Vissa föreningar, t.ex. vissa bekämpningsmedel och herbicider, kan inte identifieras med GC-MS. De är alltför lika andra relaterade föreningar. Men för de flesta organiska analyser av miljöprover, inklusive många större klasser av bekämpningsmedel, är GC-MS mycket känslig och effektiv.

Kriminalteknisk kriminalteknik

GC-MS kan analysera partiklar från en människokropp för att hjälpa till att koppla en brottsling till ett brott. Lagstiftningen godtar att GC-MS används för att analysera brandrester. American Society for Testing Materials (ASTM) har faktiskt en standard för analys av brandrester. GCMS/MS är särskilt användbart här eftersom proverna ofta innehåller mycket komplexa matriser och resultaten, som används i domstol, måste vara mycket exakta.

Brottsbekämpning

GC-MS används för att upptäcka olagliga droger och kan så småningom ersätta hundar för narkotikaspridning. Den används också ofta inom rättsmedicinsk toxikologi. Den hjälper till att hitta droger och/eller gifter i biologiska prover från misstänkta, offer eller döda kroppar.

Säkerhet

Efter terroristattackerna den 11 september 2001 har system för att upptäcka sprängämnen blivit en del av alla amerikanska flygplatser. Dessa system bygger på en mängd olika tekniker, varav många är baserade på GC-MS. Det finns endast tre tillverkare som är certifierade av FAA för att tillhandahålla dessa system. Den första är Thermo Detection (tidigare Thermedics), som tillverkar EGIS, en GC-MS-baserad serie sprängämnesdetektorer. Den andra är Barringer Technologies, som nu ägs av Smith's Detection Systems. Den tredje är Ion Track Instruments (en del av General Electric Infrastructure Security Systems).

Analys av livsmedel, drycker och parfym

Livsmedel och drycker innehåller många aromatiska föreningar, varav en del finns naturligt i råvarorna och en del bildas under bearbetningen. GC-MS används i stor utsträckning för analys av dessa föreningar som omfattar estrar, fettsyror, alkoholer, aldehyder, terpener osv. Den används också för att upptäcka och mäta föroreningar som kan vara skadliga och som härstammar från fördärv eller förfalskning. Föroreningarna kontrolleras ofta av statliga myndigheter, till exempel bekämpningsmedel.

Astrokemi

Flera GC-MS har lämnat jorden. Två av dem åkte till Mars i Vikingprogrammet. Venera 11 och 12 och Pioneer Venus analyserade Venus atmosfär med GC-MS. Huygens-sonden i Cassini-Huygens-uppdraget landade en GC-MS på Saturnus största måne, Titan. Materialet i komet 67P/Churyumov-Gerasimenko kommer att analyseras av Rosetta-uppdraget med en chiral GC-MS under 2014.

Medicin

GC-MS används vid screening av nyfödda. Dessa tester kan upptäcka dussintals medfödda ämnesomsättningssjukdomar (även kallade medfödda fel i ämnesomsättningen). GC-MS kan bestämma föreningar i urin även i mycket små mängder. Dessa föreningar förekommer normalt inte, men de förekommer hos personer som lider av ämnesomsättningsstörningar. Detta håller på att bli ett vanligt sätt att diagnostisera IEM för tidigare diagnos och påbörjad behandling. Detta leder i slutändan till ett bättre resultat. Det är nu möjligt att testa en nyfödd för över 100 genetiska metaboliska störningar genom ett urinprov vid födseln baserat på GC-MS.

I kombination med isotopmärkning av metaboliska föreningar används GC-MS för att bestämma metabolisk aktivitet. De flesta tillämpningar bygger på användning av ¹³C som märkning och mätning av ¹³C- ¹²C-förhållanden med en masspektrometer för isotopförhållande (IRMS). En IRMS är en masspektrometer med en detektor som är utformad för att mäta ett fåtal utvalda joner och återge värden som förhållanden.